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3 乳酸菌青贮秸秆的研究趋势
近年来随着分子生物学的飞速发展和对乳酸菌研究的进一步深入,为人们提供了一个采用基因重组技术把外源纤维素酶的基因导入乳酸菌中的途径。应用这种构建的工程乳酸菌可以省去纤维素酶的生产和添加这一步骤,节约成本,因而,近年来,国内外利用乳酸菌表达外源纤维素酶基因的报道越来越多。Franca Rossi等(2001)将枯草芽孢杆菌的celA基因连接到大肠杆菌-植物乳杆菌穿梭载体pGIP73上,然后转化植物乳杆菌L.plantarum Lp80和L.plantarum B41。结果目的蛋白产生了43~59U/L的酶活。Liu等(2005)将瘤胃分解纤维素菌Fibrobacter Succinogenes的β-葡聚糖酶基因和Neocallimastix patriciarum的木聚糖酶基因xynCDBFV以及Piromyces rhizinflata的纤维素酶基因eglA分别连接到表达载体pNZ3004上,电转化乳杆菌L.reuteri Pg4,检测到了目的基因表达。Bates EEM (1989)、J S Cho (2000)等先后将内切葡聚糖酶基因从芽抱杆菌中克隆并分别在植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、溶血乳杆菌Lactobacillus johnsonii及乳酸杆菌Lactobacillus gasseri中表达;Heng NCK(1997)等将浸麻芽饱杆菌Bacillus macerans来源的内切葡聚糖酶基因在瑞士乳杆菌Lactobacillus reuteri中表达。赵莹(2008)将能降解纤维素酶系中的葡萄糖外切酶CBH11基因在非抗生素抗性表达载体(pW425t)进行重组后,将其在乳酸杆菌中进行表达并对其活性检测,结果显示,转酸性纤维素酶基因工程乳酸菌具有分泌酸性纤维素酶的功能。其中,从真菌中分离的纤维素酶可以在青贮过程中起到良好的效果。这些酶可以有效地水解其中的结构多糖,产生更多的被产酸菌株直接利用的原料物质—单糖。史瑞(2010)将来自瑞氏木酶属的纤维素酶基因CBHⅡ与表达载体pET30a重组,构建了重组质粒pETCBH。将重组质粒转化Rosetta宿主菌,获得了重组菌株Rosetta(pETCBH);利用IPTG诱导重组菌株Rosetta(pETCBH),并通过pNPC法测定了重组纤维素酶CBHⅡ的活性,其活性为2.677U/mL。并建立了一种新的REAL-TIME RT-PCR分析方法,同时利用pNPC法测定了工程菌的酶活力,为构建青贮用转纤维素酶基因乳酸菌提供了一种技术路线和对其进行相关指标评价的方法。山东大学孙磊(2005)用来自枯草芽抱杆菌Y-106的纤维素酶基因连接到大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e上,电转化导入乳酸乳球菌MG1614,携带的纤维素酶基因在乳酸乳球菌中表达并有活性,其胞外酶活为0.133U/mL。
随着转基因生物技术的发展及研究水平的不断提高,通过对乳酸菌的育种和生物学特性的认识的不断深入和对纤维素酶基因的筛选及克隆的研究,将能得到更为优良的青贮乳酸菌基因工程菌,将会大大提高秸秆青贮的效果。4 小结
利用乳酸菌青贮秸秆一直是国内外研究的焦点,但由于菌种及来源、使用剂量不同,作用的秸秆也不相同,所取得的结果也不一样。用乳酸菌和纤维素酶联合发酵秸秆取得了较好的效果,应用分子生物学技术,将纤维素酶基因转入乳酸菌中,将是乳酸菌青贮秸秆的研究重点和趋势。
青贮的方法可分为一般青贮和特殊青贮。特殊青贮又可分为半干青贮、混合青贮、添加剂青贮等。一般青贮的制作方法如下:
(1)适时收割青贮
原料所谓适时收割是指在可消化养分产量 时期收割。优质的青贮原料是调制优良青贮料的基础,一般玉米在乳熟期至蜡熟期、禾本科牧草在抽穗期、豆科牧草在开花初期收割为宜。适时收割,原料作物不仅产量高、品质好,而且水分含量适宜,青贮易成功。
(2)清理青贮设备
青贮饲料用完后,应及时清理青贮设备(青贮窖、青贮池等),将污腐物清除干净,以备再次青贮使用。
(3)调节水分
青贮原料的含水量是影响青贮成败和品质的重要因素。一般禾本科饲料作物和牧草的含水量以65%~75%为好,豆科牧草含水量以60%~70%为好。质地粗硬的原料含水量可高些,以78%~82%为宜。幼嫩多汁的原料含水量应低些,以60%为 。原料含水量较高时,可采用晾晒的方式或掺入粉碎的干草、干枯秆及谷物等含水量少的原料加以调节;含水量过低时,可掺入新割的含水量较高的原料混合青贮。
(4)切碎
青贮原料在入窖前均需切碎。原料的切碎,常使用青贮联合收割机、青贮料切碎机,也可使用滚筒式铡草机。原料一般切成2~5厘米的长度。含水量多、质地柔软的原料可以切得长些;含水量少、质地较粗的原料可以切得短些。
(5)装填和镇压
青贮原料的装填一要快速,二要压实。一旦开始装填,应尽快装满窖(池),以避免原料在窖(池)装满和密封之前腐败变质。青贮窖以一次装满为好,即使是大型青贮建筑物,也应在2~3天内装满。在装填过程中,每装30厘米(层高)就需要镇压一次。镇压时,特别要注意靠近墙和拐角的地方不能留有空隙。
(6)密封
原料装填完毕,立即密封和覆盖,隔绝空气并防止雨水渗入。
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